9 生物医学光学成像

重点：

荧光显微成像
激光共聚焦扫描显微成像
多光子荧光扫描显微成像
二/三次谐波扫描显微成像
光学相干层析成像OCT
STORM/PALM, STED, SIM
各种能级图

成像原理
利用生物体某些光学特性的时空变化来获取光学图像

优点

1. 不会产生辐射伤害
2. 应用尺度广
3. 利用透射散射反射，实现多维成像
4. 监控化学和动力学变化
5. 选择性好、精密度高、灵敏度大

9.1 普通显微成像

单透镜成像

\(\frac{1}{u}+\frac{1}{v}=\frac{1}{f}\)，放大倍数=\(\frac{v}{u}\)

科勒照明（4f）

通过焦点的设置，使不均匀光源能够均匀照射样本

在收集透镜后放场光阑，达到调整视场的目的（调整样本被照亮的区域）

在场透镜后放孔径光阑，达到调整入角度的目的

分辨率
见6.3
提高分辨率最佳的形式是提高物镜的n，用油或者水

暗场显微成像
即成像的背景是暗的，适用于高透明度样本

暗场显微镜使用挡光板，产生中空的锥形光，背景是暗的，成像时物镜仅仅收集到来自样品对照明光的散射信号
限制：图像亮度低

相衬显微成像
利用光透射产生的光程差成像，主要用于透明样本等光强变化小的情况

微分干涉显微成像

成像步骤

1. 先得到线偏振光，利用棱镜分出s光和p光
2. 透射样品
3. 将s光和p光叠加干涉，得到图像

比相衬成像的图像质量高伪影少

最终是利用光程差的微分成像，图像有浮雕感

落射荧光显微成像
利用短波激发光激发长波荧光成像

使用同一个物镜，滤光盒是一个长波通滤波器（低通），从右到左是：激发滤光片，二向色镜，发射滤光片
观察前需要用探针修饰

缺点
不能分层，荧光多层堆叠，平面的分辨率低，深度分辨率低；光漂白强（荧光消失快）

9.2 激光显微成像

全内反射荧光显微成像
利用全反射时产生的倏逝波对样品进行激发
倏逝波穿透力弱，约100~200nm，因此只有界面处约100nm的荧光信号被激发
是研究细胞膜表面问题的手段
光漂白降低，分辨率提高

光片照明显微镜
激发光通过柱面镜产生光片，物镜位于光片的侧面，样品旋转，产生荧光，得到切片图像，进行重构

优点
光漂白降低，分辨率提高，成像速度快，允许多色成像

缺点
样品制备复杂，受限于物镜的大小，样品很小，无法进行活体成像

激光共聚焦扫描显微成像

每次扫描一个点的信息；点光源、物点、针孔成共轭关系
焦点以外的信息被小孔挡住，减小焦点信息的干扰，空间分辨率高
探测器是光电倍增管（PMT），获取光强信息，没有分布信息
通过移动物镜来改变成像点

缺点

1. 扫描深度不足（<80um）
2. 光漂白严重，几乎整个Z轴都受光
3. 不能产生紫外荧光（激发光的波长更短，对生物有害）
4. 空间分辨率收到衍射极限限制

FRET
Fluorescence Resonance Energy Transfer
当两种荧光满足下图时，会发生荧光能量转移

转移的荧光强度满足:\(I_A=I_D\cdot \frac{1}{R^6}\)
故只有当两种探针相距很近时才能探测
可以判断结合是否成功

FLIM
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
荧光寿命在不同环境中不同，利用荧光寿命的变化感知环境的变化
例如，肿瘤在酸性微环境中，而在酸性环境中荧光寿命很短
与FRET互补

9.3 非线性光学显微成像

多光子激发荧光显微成像

注意，多光子过程存在光子的吸收和释放，存在能量损耗
多光子与单光子的区别仅在吸收能量的过程，发出荧光的过程是一致的

三光子激发产生的荧光信号比双光子弱得多
吸收多光子的几率是吸收单光子几率的亿分之一
故需要能够在瞬间将光子集中发生的设备（高峰值功率，短脉冲+高NA物镜）

n光子激发，则激发光的强度与荧光的强度关系为\(I_{out}\propto I_{in}^n\)

飞秒激光器
\(1秒=10^{15}飞秒\)
可激发纯紫外染料

双光子扫描显微镜

左边是共聚焦，右边是双光子，不需要针孔
由于多光子激发的概率极低，只有焦点除得到激发，故不需要针孔去阻挡除

显著特点

1. 扫描深度深（300~800um）
2. 高光子密度只在焦点处，其他可以忽略
   故焦点外光损伤小，激光刺激和漂白也只在焦点位置
3. 可以激发纯紫外染料，生物损伤小
   满足\(\lambda_{单光子}<\lambda_{双光子}<2\lambda_{单光子}\)时能够激发荧光
4. 和荧光的波长差距大，易于分离激发光和荧光

二/三次谐波扫描显微成像

注意这个图中的能级不是实线，是虚能级

与多光子的区别

1. 不涉及能级变化，即没有光子的吸收和释放，没有热损失
2. 二次谐波生成只发生在非中心对称介质的界面
3. 二次谐波信号的波长是泵浦激光波长的一半（多光子没有数值关系，必须实验测定）
4. 可以用于非荧光、无标记的样品

相同点：非线性激发，无需针孔

二次和三次的区别

1. 二阶非线性效应和三阶非线性效应
2. 二次谐波生成只能发生在非中心对称介质，三次任意
   二次三次的对比可以找出病变组织
3. 波长分别是泵浦源的二/三分之一

相同点：没有光子吸收，不用针孔，前向探测居多，可以用于非荧光、无标记样品

受激拉曼SRS/相干反斯托克斯成像CARS

自发拉曼：提供p，发射s，概率低，强度弱
受激拉曼：提供p和s，发射s，概率高，强度大

CARS
无需荧光标记；信号波长短，无荧光干扰；信号强，成像快

SRS

发射p和s，其中p是泵浦，s产生受激辐射
通过信号中的\(\Delta I_s和\Delta I_p\)来获取样品信息
注意到s不是连续的，pOutput和sInput是有关的

比CARS的优势：与样品浓度成线性关系；提供无背景且易于解释的化学对比

9.4 层析成像

B超
利用声波再不同组织界面发生反射折射等，获取不同层面的信息

用光信号代替声波？

困难
时域上无法区分，脉冲相隔时间短（3.3fs）
有效光信号弱，弹道光太少了（红色是弹道光，打错字了）

光学相干层析成像（OCT）
是对眼睛成像的唯一手段

弱相干成像原理

左边的是相干性好，相干长度长的光的干涉图像，右边是相反的图像
相干性弱的光干涉后的相干长度短，且干涉信号集中在零光程差处
反应了深度（z轴）的信息，避免蛇形光和扩散光干扰

其中\(l_c\)是相干长度（包络长度），只有当\(2\Delta z换言之，当\(2\Delta z>l_c\)时，光束不在同一个包络面内，将不同层面的光分开（时域），分辨率很高

\(l_c=\frac{4\ln{2}}{\pi}\cdot\frac{\lambda_0^2}{\Delta\lambda}\)，其中\(\Delta\lambda\)是光强下降到\(e^{-1}\)时的波长，\(\lambda_0\)是中心波长
带宽更宽的光谱，\(l_c\)更小，分辨率更高

包络的强度反映光强分布（即一层图像），包络的传递时间反映成像深度

OCT的分辨率
横向和纵向分辨率是独立的
纵向分辨率\(\delta z=\frac{l_c}{2}\)，横向分辨率由物镜焦距和光斑尺寸决定，\(\Delta x=\frac{4\lambda}{\pi}\cdot\frac{f}{d}\)
故即使没有严格的聚焦，OCT依然有精确的纵向分辨率

OCT的成像过程任然是依靠干涉光强信息，上面是提高分辨率的方法

OCT光源

1. 生物组织吸收少
2. 生物组织散射小
3. 横向纵向分辨率高
4. 功率高
5. 价格低。。。

频域OCT
时域OCT依靠改变\(\Delta z\)来改变干涉光强，频域OCT依靠改变\(k\)来改变干涉光强
\(I\sim 2E_rE_s\cos{(2k\Delta z)}\)，是一个正弦波

可见改变\(\Delta L\)对光谱的影响，对其做傅里叶变换得到频域上的冲击波形
\(\Delta L\)影响\(\omega\)，在频域上分开了z轴

由于傅里叶变换的线性性，可以同时对不同层面成像，得到的是离散的冲击波形，成像很快

几种不同的OCT

OCT特点

1. 空间分辨率：高，横向纵向独立
2. 成像深度：比显微系统深很多
3. 成像时间：短，可以动态化成像
4. 临床适用性：损伤小，于内窥镜和导管结合
5. 对冠状动脉，眼睛，神经等成像，避免切除性活检的伤害

光学成像和超声成像的对比

1. 对比度：光学高
2. 深度和分辨率：成像深度大时，光学质量低（z轴分辨率低）

光学成像的分斌率随深度增加而变差

光声层析成像（PAT）
用激光打击组织，组织产热，发生振动，产生声波（在体式流式细胞仪）
特点是光学对比度高，声学分辨率、深度高
避免了光散射的影响，间距光学和超声成像的优点
缺点：无法做层析，对图像的判断、分析需要很大的经验，发光信号弱时成像速度慢
在成像时必须选择目标组织会特异性吸收的波长的光，否则信噪比很高

光声效应
短脉冲激光经过扩束，照射生物样本，组织快速吸收能量发热，周围组织热胀冷缩产生热弹效应，产生压力波（超声波）

活体成像的衰减曲线

绿色的是衰减曲线，一般PAT使用1700nm左右的波长的光

9.5 远场超分辨显微成像

光学成像的限制始终是衍射极限
将点光源经过光学系统成像的光强分布用点扩散函数表示，实际上就是光学系统的单位冲激响应PSF(x,y)
和激励卷积得到任意响应

受激辐射耗尽显微成像(STED)

绿光是激励，红光是擦除光（空心的圆）
绿光将荧光物质泵浦到高能级，红光会使高能级物质受激辐射
在红光的空心区域，高能级荧光物质不会受激辐射，而是正常跃迁发出荧光
由于荧光的波长（很宽，是带）和受激辐射的波长（单一）不同，使用滤波器将红光过滤就得到了很细的荧光
绿光是铅笔，红光是橡皮擦

但是这依然无法避免衍射
使用PMT作为Detector，不记录分布，只记录一个点的光强

擦除的过程具体而言
是擦除光的光强很大，使受激辐射强于自发辐射（荧光）
在激励和擦除光的交集处，受激辐射占主导

擦除光的形状由涡旋相位滤片得到

最大分辨率\(\Delta x=\frac{\lambda}{2n\sin{\alpha}\sqrt{1+I_{max}/I_{sat}}}\)
其中Imax是擦除光的光强极大值，Isat是荧光分子饱和激发光强
提高Imax可以提高分辨率

STED光（擦除光）可以是高峰值功率的脉冲光，也可以是高功率的连续光
前者的平均功率低，对样品的热损伤小；后者更简单，便宜

光激活定位显微技术(PALM)
既然衍射极限是两个光点的像重合，那么一开始就只成一个像就好了

成像过程是：
在分辨率极限范围内让两个荧光分子分别单独发光
对单个光斑做高斯拟合，取中心点作为荧光分子的实际位置
当前一个荧光分子完全漂白后照亮下一个
各个荧光分子拼接到一张图上

缺点：
荧光分子激活、漂白时间长，成像速度慢
荧光分子漂白后无法再激活，一次性
无法持续成像

随机光学重构显微技术(STORM)
使用光开关控制荧光分子是否发出荧光
类似于PLAM

下面的绿光，红光仅代表对应的蛋白的光，而非光的波长
其中绿色的是光开关
当受到绿光照射时开关持续打开，此时照射微弱的红光可以使荧光蛋白发出荧光
若照射很强的红光则会使已经打开的开关关闭

红色的蛋白可以替换，可以将多种不同的开关一起用，成彩像

逻辑是：
绿光，强制持续打开；强红，关闭信号
弱红，若开关打开则发光

优点：
荧光开关速度快，比PLAM快
每个荧光分子可以反复开关，可以多次成像
短时间多次尝试测量，受荧光分子随机运动的影响小

缺点：
成像依然不够快，不能做活体实时成像

结构照明显微技术(SIM)
利用摩尔效应
若样品的空间频率为k，结构光的空间频率为k0
在其照射下会产生\(k_{min}=k-k_0到k_{max}=k+k_0\)的摩尔纹

c中粗线为光学系统的分辨率极限，使用一个k0的结构光相当于将这个圆进行平移
最后得到的包络是SIM的分辨率极限
由于k0，km是知道的，可以通过\(\vec{k}=\vec{k_m}+\vec{k_0}\)得到原始图像信息

相当于结构光将成像系统的分辨率极限由km扩展到km+k0

a图中上面用于产生结构光，用CCD记录
对记录的到原始信息进行FFT，对频域信号进行配准和融合（减去k0），得到的频谱做iFFT，得到时域信号
成像时间很短

总结

STED最终的绿光周围还有一圈红光，不过会被滤波器过滤
STORM是activation，PALM是localization

• PLAM/STORM图像采集慢
• STED光路复杂，贵，对稳定性要求高
• SIM分辨率提高有限